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    染色質免疫共沉淀值得注意的15個細節

    發布時間: 2021-09-13  點擊次數: 1408次

    染色質免疫共沉淀,又叫 Chip(Chromatin Immunoprecipitation)。Chip 又正好是英語里面薯片的意思。為了有趣,就叫薯片實驗吧。做薯片做了幾個月,時間不長,但深刻體會到了魔鬼都在細節中和細節決定成敗?,F在把值得注意的 15 個細節總結如下:

    1、cell counting:盡量做到準確準確再準確,否則會影響 input 結果。 

    2、cross link:甲醛的終濃度是 1%,這個基本所有的 protocol 上都會強調。 

    3、resuspend cells with SDS:一定要選用小的 tip 頭,在液面下吹打,否則很容易產生氣泡,后面的 sonication 就麻煩了。 

    4、sonication:Chip 實驗中最重要的一部分,合適的條件要自己摸索,可以一次嘗試不同次數的 sonication,然后建議采用 EZ-ChIP 上推薦的方法看看 sonication 的效果如何。

    5、加入 salmon sperm DNA/Protein A or G 之前要先混勻,因為 salmon sperm DNA 是很粘稠的物質,若不混勻,后面你會發現 beads 的量不一樣,自然也會影響實驗的結果。 

    6、wash 的時候前面幾個步驟可以不用洗的太干凈,但最后一個要盡量吸干凈,必要時可用 gel loading tips 吸。 

    7、含 beads 的 samples 離心時,有的 protocol 上推薦是 1000rpm,45 秒,但可以根據情況調整,但要注意轉速不能太快防止 beads 破碎。(當然如果采用的是 magnetic 的 beads 就不存在這個問題)

    8、reverse crosslink 可以是 65°C 4 個小時,也可以 overnight。 

    9、reverse crosslink 后的在進行下面步驟之前建議先離心,把蒸發到離心管蓋子上的部分離下來。 

    10、每次行 real time PCR 之前都要把 sample 離心保證取樣的準確。 

    11、1~10ul 的槍取 3ul 以上才比較準確,所以考慮好自己 PCR 反應體系的配置。

    12、一個 Chip 實驗一般需要 3~4 天的時間。但是,其中有幾個步驟是可以中途停下來的。畢竟,誰也沒有辦法不眠不休地連續 3、4 天一口氣做完。下面是幾個可以停下來喘口氣的地方: 

    (1)細胞收集:用含蛋白酶抑制劑的 PBS 洗滌離心,去上清的細胞收集液可置-80°C 凍存; 

    (2)用 SDS 重懸細胞后可置-80°C 凍存; 

    (3)sonication 結束,離心后的上清置新的離心管后可-80°C 凍存; 

    (4)reverse cross-link 后的標本可-80°C 凍存。凍存后就可以該干啥干啥去了。想接著做的時候,拿出來解凍就可以啦。 

    13、agarose beads 的 wash 過程中以及后面的 DNA 提取過程中乙醇的 wash,可以用細胞室的那種吸引器,接上 200ul 的 tip 頭吸,這樣會節省很多時間(每個實驗室情況可能不一樣)。

    14、DNA 提取后建議用水溶解 DNA,因為 TE buffer 里的 EDTA 可能會影響 PCR 反應體系中的 Mg2+。

    15、溶解 DNA 的水量可以根據 PCR 反應體系的要求適當調整。

    綜上所述,我們探討了做 Chip 實驗需要注意的 15 個小細節。細節雖小,但是卻很重要。需知魔鬼都是在細節中!

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